Historia peptydów: od insuliny do syntezy na żywicy

31 października 1920 roku, około drugiej w nocy, dwudziestoośmioletni chirurg z miasteczka London w prowincji Ontario zapisał w notatniku pomysł: podwiązać przewody trzustkowe u psów, odczekać kilka tygodni, wyciąć narząd i zrobić wyciąg. Notatka miała dwadzieścia parę słów. Nazywał się Frederick Banting, urodził się 14 listopada 1891 roku, nie miał żadnego doświadczenia w badaniach podstawowych, a zapisek zrobił dlatego, że nazajutrz miał prowadzić zajęcia o funkcjach trzustki i wieczorem czytał do nich artykuł patologa Mosesa Barrona. Historia peptydów jako leków i odczynników ma kilka możliwych początków, ale ten jest najbardziej wymowny: kartka zapisana w nocy przez człowieka, którego nikt jeszcze nie traktował poważnie.

Zanim ktokolwiek nazwał to peptydem

Chemia była szybsza od medycyny. Hermann Emil Fischer (1852–1919), berliński chemik organik, zaproponował, że aminokwasy w białkach łączą się wiązaniem amidowym. W 1901 roku wspólnie z Ernestem Fourneau otrzymał pierwszy wolny dipeptyd — glicyloglicynę, dwie cząsteczki najprostszego aminokwasu spięte jednym takim wiązaniem. Uzyskali ją przez częściową hydrolizę diketopiperazyny glicyny, co brzmi jak drobiazg preparatywny, a było dowodem, że da się zamknąć w kolbie to, co dotąd znano tylko z rozkładu białek.

Nazwa przyszła rok później i przy okazji jednego z ładniejszych zbiegów okoliczności w historii biochemii. 22 września 1902 roku, na czternastym zjeździe niemieckich przyrodników i lekarzy w Karlowych Warach, Franz Hofmeister wygłosił wykład plenarny o możliwej budowie białek. Zaraz po nim mówił Fischer — i przedstawił w istocie tę samą koncepcję łańcucha aminokwasów spiętego wiązaniami amidowymi. Obaj doszli do niej niezależnie, stąd dzisiejsza nazwa: teoria Fischera–Hofmeistera. To wtedy Fischer wprowadził też określenie „peptyd”, wyprowadzone od pepsis (trawienie) i peptonów, czyli produktów rozkładu białek.

Jeszcze w tym samym roku Fischer odebrał Nagrodę Nobla z chemii — ale, co bywa mylące, nie za peptydy. Komitet uzasadnił nagrodę pracami nad syntezami cukrów i puryn. Peptydy były wtedy jego świeżym, jeszcze niedocenionym wątkiem.

Wątkiem, który pociągnął zdumiewająco daleko. W 1907 roku Fischer wraz z Axhausenem opublikował w „Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft” (t. 40, s. 1754–1767) syntezę oktadekapeptydu: osiemnaście reszt aminokwasowych, w tym piętnaście glicyn i trzy leucyny, w układzie Leu-(Gly)₃-Leu-(Gly)₃-Leu-(Gly)₉. Poprzedni rekord długości pobili o sześć reszt, a enzymy trawiły ten łańcuch tak jak naturalne białko. Haczyk tkwił w tym, że Fischer nie dysponował odwracalnymi grupami ochronnymi, więc nad kolejnością reszt panował tylko częściowo. Łańcuch był długi, lecz nie był projektem — raczej dowodem, że da się.

Toronto, styczeń 1922: chłopiec, który umierał w szpitalnym łóżku

Banting przedstawił swój pomysł Johnowi Macleodowi, szefowi fizjologii na Uniwersytecie w Toronto, 8 listopada 1920 roku. Macleod nie był zachwycony, ale ostatecznie dał mu miejsce w laboratorium, kilka psów i studenta — Charlesa Besta. Prace ruszyły 17 maja 1921 roku. Latem obaj mieli wyciąg, który obniżał glikemię u psów po pankreatektomii. W grudniu do zespołu dołączył biochemik James Bertram Collip, którego zadaniem było oczyszczenie tej mętnej, drażniącej cieczy do postaci nadającej się do podania człowiekowi.

Leonard Thompson trafił do Toronto General Hospital 2 grudnia 1921 roku. Miał czternaście lat, cukrzycę typu 1 i wtedy — jak wszyscy tacy pacjenci — rokowanie liczone w tygodniach. 11 stycznia 1922 roku dostał zastrzyk wyciągu przygotowanego przez Bantinga i Besta. Glikemia spadła nieznacznie, a w miejscu wkłucia utworzył się ropień: preparat był zbyt zanieczyszczony. Drugą serię, tym razem z materiału oczyszczonego przez Collipa, podano 23 stycznia. Cukier we krwi wrócił do normy w ciągu doby, a stan chłopca poprawił się natychmiast.

Thompson urodził się w 1908 roku i zmarł w 1935, w wieku dwudziestu siedmiu lat, na odoskrzelowe zapalenie płuc i powikłania cukrzycy. Przeżył trzynaście lat, których wcześniejsza medycyna nie potrafiła nikomu takiemu dać.

Kto odkrył insulinę?

Formalnie Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny przyznano 25 października 1923 roku Frederickowi Bantingowi i Johnowi Macleodowi. Banting uznał pominięcie Besta za niesprawiedliwe i podzielił się z nim swoją połową nagrody pieniężnej, a Macleod zrobił to samo wobec Collipa. Do dziś część historyków uważa, że skład laureatów źle oddaje faktyczny podział pracy, bo bez oczyszczania wykonanego przez Collipa styczeń 1922 skończyłby się porażką. Było to zresztą najszybsze uhonorowanie odkrycia w historii Nobli — od pierwszego zastrzyku minęły niecałe dwa lata.

Do komitetu spływały też protesty. Rumuński fizjolog Nicolae Paulescu wysłał 22 czerwca 1921 roku do belgijskiego „Archives Internationales de Physiologie” pracę o roli trzustki w przyswajaniu pokarmu; ukazała się w sierpniowym numerze. Wyciąg, który opisał, nazwał pankreiną, a 10 kwietnia 1922 roku uzyskał na metodę jej wytwarzania rumuński patent nr 6254. Po ogłoszeniu werdyktu napisał do komitetu noblowskiego, powołując się na pierwszeństwo. Sprawy nie uwzględniono, a w 1971 roku szkocki lekarz Ian Murray wrócił do niej publicznie, argumentując, że Paulescu został potraktowany niesprawiedliwie. W Rumunii spór trwa do dziś.

Osobno warto zapamiętać jeszcze jeden gest. 23 stycznia 1923 roku Banting, Best i Collip otrzymali amerykańskie patenty na insulinę i metodę jej wytwarzania, po czym odsprzedali je Uniwersytetowi Toronto za symbolicznego dolara od osoby. Chodziło o to, żeby nikt inny nie zamknął tej cząsteczki w monopolu. Bantingowi przypisuje się zdanie: „Insulina należy do świata, nie do mnie”.

1953: pierwszy hormon zbudowany od zera

Insulina długo pozostawała czarną skrzynką — działała, choć nikt nie wiedział, jak wygląda. Zmienił to Frederick Sanger w Cambridge, który do 1955 roku odczytał pełną sekwencję pięćdziesięciu jeden aminokwasów insuliny i pokazał, że tworzą one dwa łańcuchy spięte mostkami disiarczkowymi. Była to pierwsza w historii ustalona sekwencja jakiegokolwiek białka; przy okazji obaliła pogląd, że białka są mieszaninami o rozmytym składzie, bo okazało się, że każde ma jedną, ściśle określoną strukturę. Nagrodę Nobla z chemii Sanger dostał za to w 1958 roku.

Równolegle Vincent du Vigneaud (1901–1978) z Cornell Medical College szedł tropem siarki w hormonach tylnego płata przysadki. Ustalił budowę oksytocyny — krótkiego łańcucha z mostkiem disiarczkowym — i, co ważniejsze, złożył ją w kolbie. Doniesienie „The Synthesis of an Octapeptide Amide with the Hormonal Activity of Oxytocin” ukazało się w „Journal of the American Chemical Society” w 1953 roku (t. 75, s. 4879–4880), a pełna praca, już pod tytułem „The Synthesis of Oxytocin”, rok później (t. 76, s. 3115–3121). Ten oryginalny tytuł bywa źródłem zamieszania: dziś liczymy w oksytocynie dziewięć reszt, ale w ówczesnej konwencji mostek cystynowy traktowano jako jedną jednostkę, stąd „oktapeptyd”.

Kto pierwszy zsyntetyzował hormon peptydowy?

Vincent du Vigneaud, w 1953 roku, a chodziło o oksytocynę. Nagrodę Nobla z chemii odebrał w 1955 roku za prace nad ważnymi biochemicznie związkami siarki, a zwłaszcza za pierwszą syntezę hormonu polipeptydowego. Znaczenie tego wyniku wykraczało poza samą cząsteczkę: pokazał, że hormon nie musi pochodzić od zwierzęcia, żeby zachowywać się identycznie jak naturalny. Od tego momentu ustalenie sekwencji przestało być końcem badania, a stało się instrukcją wykonawczą.

1963: żywica, która przedefiniowała zawód chemika

Synteza oksytocyny była wyczynem, ale wyczynem koszmarnie pracochłonnym. W klasycznej metodzie roztworowej po każdym dołączeniu aminokwasu trzeba było oczyścić produkt przez krystalizację — a im dłuższy łańcuch, tym gorzej się to udawało. Robert Bruce Merrifield z Rockefeller Institute wpadł w 1959 roku na pomysł tak prosty, że przez kilka lat wzbudzał głównie sceptycyzm: zakotwiczyć koniec karboksylowy pierwszego aminokwasu na nierozpuszczalnej żywicy i po każdym cyklu po prostu spłukiwać nadmiar odczynników.

Pierwszy raz pokazał to na zjeździe FASEB wiosną 1962 roku, a pracę „Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide” opublikował w 1963 roku w „Journal of the American Chemical Society” (t. 85, s. 2149–2154). Zsyntetyzował w niej czteroresztowy peptyd Leu-Ala-Gly-Val. Artykuł ma jednego autora i do dziś należy do najczęściej cytowanych w historii tego czasopisma.

Na czym polega synteza peptydów na fazie stałej?

Rosnący łańcuch jest przez cały czas przyczepiony do ziarenek nierozpuszczalnej żywicy, a kolejne zabezpieczone aminokwasy dodaje się w powtarzalnych cyklach odbezpieczania i sprzęgania. Po każdym cyklu nadmiar odczynników i produkty uboczne odpłukuje się, zamiast oczyszczać produkt pośredni — nic nie trzeba przenosić między naczyniami, więc nic nie ginie po drodze. Ta jedna zmiana sprawiła, że proces stał się powtarzalny, a przez to możliwy do zautomatyzowania.

Do 1965 roku Merrifield miał już działający automat, opisany na łamach „Science”. Cztery lata później, wspólnie z Berndem Gutte, złożył rybonukleazę A — enzym o stu dwudziestu czterech resztach. Wymagało to 369 reakcji chemicznych i 11 391 operacji maszyny. Był to argument nie do zbicia: metoda skaluje się do cząsteczek biologicznie czynnych, nie tylko do ćwiczeń warsztatowych. Nagrodę Nobla z chemii Merrifield odebrał w 1984 roku za opracowanie metodyki syntezy chemicznej na stałej matrycy. Każda dzisiejsza fiolka odczynnika peptydowego jest wnukiem tego pomysłu.

Podwzgórze, dwa laboratoria i ponad dwa miliony mózgów

Pod koniec lat pięćdziesiątych dwaj badacze niezależnie ruszyli za hipotezą, że podwzgórze steruje przysadką za pomocą krótkich peptydów. Roger Guillemin (11 stycznia 1924 – 21 lutego 2024), urodzony w Dijon, pracował na materiale owczym. Andrzej Wiktor Schally, urodzony 30 listopada 1926 roku w Wilnie, syn generała brygady Kazimierza Schally'ego, szefa gabinetu prezydenta Ignacego Mościckiego — na świńskim. We wrześniu 1939 roku Schally uciekł z Polski wraz z prezydentem i całym rządem do Rumunii; do Wielkiej Brytanii dotarł w 1945, do Kanady w 1952, doktorat z endokrynologii obronił w McGill w 1957. Zmarł 17 października 2024 roku w Miami Beach, w wieku 97 lat.

Skala tej pracy jest dziś trudna do wyobrażenia. Zespół Schally'ego rozpreparował około 250 000 świńskich podwzgórzy, żeby uzyskać jakieś 5 mg tyreoliberyny (TRH) — ilość wystarczającą do ustalenia struktury. Grupa Guillemina przerobiła w sumie ponad dwa miliony podwzgórzy owczych. W 1969 roku obie ogłosiły tę samą odpowiedź: TRH to tripeptyd pyroGlu-His-Pro-amid. Trzy reszty. Ćwierć miliona świńskich mózgów na trzy reszty.

Dwa lata później poszło jeszcze ciaśniej. Z prawie 160 000 świńskich mózgów Schally wyciągnął około 800 mikrogramów gonadoliberyny (LHRH) i przekazał ten materiał chemikom — Hisayukiemu Matsuo i Yoshihiko Babie — którzy z takiej ilości odczytali pełną sekwencję dekapeptydu i potwierdzili ją syntezą.

Rywalizacja obu laboratoriów ciągnęła się ponad dwadzieścia lat i nie była elegancka; Schally przez pewien czas pracował u Guillemina i rozstali się w złych stosunkach. Przy TRH zespół Schally'ego opublikował wynik jakieś 37 dni wcześniej. Przy somatostatynie kolejność była odwrotna: grupa Guillemina opisała ją w 1973 roku na łamach „Science”, a Schally wyizolował ją ze świńskich podwzgórzy i opublikował strukturę w 1976 roku w „Biochemistry”.

Za co przyznano Nagrodę Nobla w 1977 roku?

Nagrodę w dziedzinie fizjologii lub medycyny podzielono: połowę wspólnie Rogerowi Guilleminowi i Andrzejowi Schally'emu za odkrycia dotyczące wytwarzania hormonów peptydowych przez mózg, a drugą połowę Rosalyn Yalow za opracowanie radioimmunologicznego oznaczania hormonów peptydowych. Ten podział ma sens techniczny, nie tylko kurtuazyjny. Bez metody Yalow, pozwalającej wykrywać stężenia rzędu pikogramów, żadna z dwóch grup nie miałaby jak śledzić aktywności w setkach frakcji z kolejnych rozdziałów chromatograficznych.

Era analogów, czyli od hormonu do cząsteczki projektowanej

Kiedy zna się sekwencję i potrafi ją odtworzyć na żywicy, pojawia się kolejny ruch: zmienić coś celowo. Z gonadoliberyny opisanej przez zespół Schally'ego wyprowadzono leuprolid, dziewięcioresztowy analog dopuszczony przez FDA 9 kwietnia 1985 roku. Ta sama logika dała analogi somatostatyny i analogi GHRH, których nowsi krewni figurują dziś w katalogach odczynników — w naszym choćby tesamorelina.

Równolegle biegła druga droga: nie synteza chemiczna, lecz produkcja biologiczna. 28 października 1982 roku FDA zatwierdziła Humulin — ludzką insulinę wytwarzaną w zmodyfikowanych bakteriach, pierwszy zarejestrowany lek uzyskany techniką rekombinacji DNA. Wniosek wpłynął w maju, decyzja zapadła po pięciu miesiącach, przy ówczesnej średniej wynoszącej trzydzieści i pół miesiąca.

Najbardziej nieprawdopodobny wątek zaczął się w 1992 roku w szpitalu weteranów na Bronksie. John Eng wyizolował z jadu helodermy arizońskiej peptyd nazwany egzendyną-4 — łańcuch trzydziestu dziewięciu reszt, podobny w działaniu do ludzkiego GLP-1, ale znacznie trwalszy. Przez trzy lata nie potrafił zainteresować nim żadnej dużej firmy; pomysł leku z jadu jaszczurki brzmiał niepoważnie, a resort weteranów odmówił finansowania patentu, który Eng zgłosił w 1993 roku na własną rękę. Licencję kupiła w 1996 roku niewielka Amylin Pharmaceuticals, a powstały z tego eksenatyd trafił na rynek amerykański w kwietniu 2005. Późniejsze analogi tej klasy poszły dalej: semaglutyd uzyskał pozwolenie na dopuszczenie do obrotu w Unii Europejskiej 8 lutego 2018 roku, a działający na dwa receptory naraz (GIP i GLP-1) tyrzepatyd — 15 września 2022. W obrocie badawczym te same cząsteczki występują jako odczynniki, na przykład semaglutyd i tyrzepatyd, przeznaczone wyłącznie do zastosowań laboratoryjnych.

Ile leków peptydowych jest dziś dopuszczonych do obrotu?

Przeglądy branżowe podsumowujące rok 2024 podają liczbę rzędu stu dwudziestu peptydowych produktów leczniczych obecnych na rynku. Tempo rejestracji nie jest zawrotne — w 2024 roku FDA dopuściła trzy takie preparaty: palopegteryparatyd (9 sierpnia 2024), pegulicjaninę, czyli środek obrazujący (17 kwietnia 2024), oraz lewacetyloleucynę (24 września 2024), przy czym autorzy zestawienia sami zaznaczają, że ta ostatnia peptydem nie jest. Warto pamiętać, że dane o wielkości tego rynku różnią się między źródłami nawet kilkukrotnie, więc do konkretnych prognoz miliardowych podchodziłbym ostrożnie.

Czego ta historia nie mówi o dzisiejszych odczynnikach

Kilka dat, które warto trzymać razem, bo dopiero w takim zestawieniu widać tempo:

• 1901 — pierwszy wolny dipeptyd (Fischer i Fourneau)
• 1902 — Karlowe Wary: teoria Fischera–Hofmeistera i słowo „peptyd”
• 1922 — pierwsze podanie wyciągu trzustkowego człowiekowi (Toronto)
• 1953 — pierwsza synteza hormonu peptydowego (du Vigneaud)
• 1963 — synteza na fazie stałej (Merrifield)
• 1969 — struktura TRH, ustalona przez dwa konkurujące zespoły

Ponad sześćdziesiąt lat od żywicy Merrifielda zrobiło z syntezy peptydów rzemiosło katalogowe. Tripeptyd, na który Schally poświęcił ćwierć miliona świńskich podwzgórzy, można dziś zamówić w gramach. To ogromne ułatwienie, ale też źródło nieporozumienia: łatwość wytworzenia cząsteczki nie mówi nic o tym, czy została ona kiedykolwiek rzetelnie przebadana. Zdecydowana większość peptydów obecnych w obrocie badawczym — od BPC-157 po nowsze fragmenty i mieszanki — nie ma statusu produktu leczniczego w Unii Europejskiej i występuje wyłącznie w publikacjach przedklinicznych, najczęściej z hodowli komórkowych i modeli zwierzęcych.

Historia z Toronto ma tu jeszcze jeden morał, rzadko przywoływany. Preparat Bantinga i Besta z 11 stycznia 1922 roku był chemicznie tą samą substancją co ten z 23 stycznia. Różniła je czystość — i tylko dlatego pierwsze podanie skończyło się ropniem, a drugie normalizacją glikemii. Sto lat później to wciąż ta sama zmienna decyduje o tym, czy wynik eksperymentu w ogóle da się interpretować. Dlatego odczynniki peptydowe sprzedawane są z certyfikatem analizy i przeznaczone są do badań laboratoryjnych, nie do stosowania u ludzi ani zwierząt.

Materiał ma charakter informacyjny. Wszystkie produkty Polar Peptides przeznaczone są wyłącznie do badań laboratoryjnych i nie do spożycia przez ludzi ani do zastosowań medycznych lub diagnostycznych.