Ile peptydu naprawdę jest w fiolce? Masa netto kontra czystość

Na etykiecie jest „10 mg". Waga analityczna to potwierdza — 10,1 mg proszku w fiolce. A w certyfikacie analizy, w wierszu, na który mało kto patrzy, stoi peptide content: 78,4%. Samego peptydu jest więc niecałe 8 mg. Pytanie ile peptydu jest w fiolce ma odpowiedź nudniejszą, niż podpowiada instynkt: mniej, niż mówi etykieta. I najczęściej nie jest to naciąganie, tylko konsekwencja tego, jak peptydy się oczyszcza i suszy.

Sprzedawcy chwalą się jedną liczbą — czystością — a milczą o drugiej. Obie są prawdziwe, obie mierzą coś innego, i dopiero razem opisują to, co leży na dnie fiolki. Poniżej: co waży te 10 mg, dlaczego 99% i 80% nie są ze sobą sprzeczne i skąd wiadomo, że akurat ta sekwencja będzie miała gorszy bilans masowy niż inna.

Masa brutto, masa netto i to, co jeszcze siedzi w proszku

Liofilizat w fiolce nie jest czystym peptydem. Bachem definiuje zawartość netto (net peptide content, NPC) jako udział materiału peptydowego — peptydu docelowego wraz z zanieczyszczeniami peptydowymi — względem przeciwjonów i wody resztkowej. Masa brutto, ta którą pokazuje waga, składa się według tej samej definicji z peptydu, przeciwjonów typu octan albo trifluorooctan oraz przylegającej wody.

AnaSpec rozpisuje to drobiazgowiej: na masę brutto liofilizatu składają się peptyd docelowy, zanieczyszczenia peptydowe, woda, resztkowe rozpuszczalniki i przeciwjon. Rozpuszczalniki z ostatnich etapów procesu to zwykle ułamki procenta, ale w bilansie też się liczą.

Przelicznik jest trywialny: masa netto = masa brutto × NPC / 100. Fiolka z 10 mg proszku o zawartości netto 85% zawiera 8,5 mg peptydu. Trudność nie leży w arytmetyce, tylko w tym, żeby ktokolwiek podał tę drugą liczbę.

Ile to zwykle jest? AmbioPharm podaje, że w większości peptydów masa netto stanowi 60–90% masy całkowitej. Przedział jest szeroki nieprzypadkowo — nie ma jednej „typowej" wartości, bo zależy ona od sekwencji, od metody oczyszczania i od tego, jak długo proszek stał otwarty. Realna liczba jest jedna i znajduje się w certyfikacie konkretnej partii.

Czystość HPLC i zawartość netto mierzą dwie różne rzeczy

To sedno nieporozumienia. Czystość oznacza się chromatografią cieczową z detekcją UV — Bachem opisuje HPLC jako metodę standardową dla peptydów i podaje zakres 210–220 nm, przy którym absorbuje wiązanie peptydowe; LifeTein wskazuje 214 nm jako wartość typową. Wynik to procent pola powierzchni głównego piku w stosunku do sumy pól wszystkich pików.

Co takie oznaczenie łapie? Zanieczyszczenia peptydowe: sekwencje z brakującą resztą, produkty skrócone, peptydy niecałkowicie odbezpieczone, formy zmodyfikowane w trakcie odszczepiania od żywicy. Wszystko to absorbuje w tym samym zakresie i pojawia się na chromatogramie jako osobne piki.

Czego nie łapie? Wody i przeciwjonów. LifeTein formułuje to wprost: woda, sole resztkowe i przeciwjony takie jak TFA nie są reprezentowane w procencie czystości HPLC w ten sam sposób co zanieczyszczenia peptydowe. Peptyd może mieć wysoką czystość i nadal zawierać wodę, TFA albo inny materiał niepeptydowy. Chromatogram bywa nienaganny, a proszek w jednej trzeciej składa się z czegoś innego niż peptyd.

Sama czystość jest przy tym wielkością stopniowaną, a nie zero-jedynkową. Bachem oferuje cztery klasy: powyżej 95% do badań NMR, krystalografii i wzorców odniesienia, 90–95% do oznaczeń ilościowych i produkcji przeciwciał monoklonalnych, powyżej 80% do jakościowego western blottingu i badań substratów enzymatycznych oraz immunograde powyżej 65% do przeciwciał poliklonalnych. Klasę dobiera się do zastosowania — to nie licytacja na dziewiątki.

Czy „czystość 99%" i „zawartość 80%" mogą być prawdziwe jednocześnie?

Tak, bez żadnej sprzeczności. Pierwsza liczba mówi: spośród materiału peptydowego w próbce 99% to sekwencja docelowa, a 1% to peptydowe produkty uboczne. Druga: spośród całej masy proszku 80% to jakikolwiek materiał peptydowy, a pozostałe 20% to sól i woda. Jedna jest udziałem powierzchni piku, druga udziałem masy. AAPPTEC ujmuje różnicę jednym zdaniem — zawartość netto informuje o proporcji materiału peptydowego do składników niepeptydowych niezależnie od tego, ile różnych peptydów w próbce siedzi.

Skąd bierze się brakująca masa

Kwas trifluorooctowy. W syntezie na fazie stałej metodą Fmoc TFA odszczepia peptyd od żywicy i zdejmuje grupy ochronne. Potem, na etapie oczyszczania chromatografią odwróconych faz, ten sam kwas służy jako odczynnik parujący jony w fazie ruchomej. Wolny TFA odparowuje przy liofilizacji, ale ten związany z dodatnio naładowanymi grupami peptydu zostaje — jako anion trifluorooctanowy, czyli przeciwjon. Przegląd Sikory i współpracowników, opublikowany w 2020 roku w czasopiśmie Pharmaceuticals, opisuje to jako stan domyślny: peptydy kationowe otrzymywane metodami fazy stałej wychodzą z procesu jako sole trifluorooctanowe.

Skala bywa większa, niż podpowiada intuicja. GenScript, oferując usługę wymiany przeciwjonu, opisuje materiał standardowy jako zawierający od 10% do 45% TFA, a wymianę gwarantowaną — poniżej 1%. Górny kraniec tego przedziału oznacza, że blisko połowa masy proszku to kwas.

Woda. Liofilizat jest higroskopijny. Nawet świeżo po suszeniu zawiera resztkową wilgoć, a po każdym otwarciu fiolki w wilgotnym powietrzu dobiera kolejną. Standardową metodą oznaczania jest miareczkowanie Karla Fischera, w którym woda reaguje ilościowo z jodem i dwutlenkiem siarki według równania 2H₂O + SO₂ + I₂ → H₂SO₄ + 2HI, a koniec miareczkowania wykrywa się potencjometrycznie po pojawieniu się nadmiaru jodu. Laboratoria analityczne ostrzegają, że próbki higroskopijne chłoną wilgoć z powietrza bardzo szybko po otwarciu, więc pomiar ma sens wyłącznie przy szczelnym opakowaniu i kontrolowanym postępowaniu z próbką.

Dlaczego akurat kwas trifluorooctowy?

Bo jest mocny, lotny i daje ostre piki w chromatografii odwróconych faz — z punktu widzenia chemika oczyszczającego peptyd to niemal idealny odczynnik. Cena jest taka, że jego anion trwale przywiera do peptydu. Wymiana przeciwjonu na octan albo chlorek jest możliwa i opisana w literaturze w kilku wariantach, ale wymaga dodatkowego etapu procesu i wiąże się ze stratą materiału. Dlatego nie jest opcją domyślną, tylko usługą zamawianą osobno.

Dlaczego zawartość netto zależy od sekwencji

Przeciwjon jest potrzebny tam, gdzie peptyd niesie ładunek dodatni — na wolnej grupie aminowej N-końca oraz na łańcuchach bocznych reszt zasadowych: lizyny, argininy, histydyny. Każde takie miejsce wiąże jedną cząsteczkę TFA o masie 114 g/mol. AnaSpec sprowadza regułę do jednego zdania: im wyższy ładunek peptydu, tym niższa zawartość peptydu.

Stąd wzór na teoretyczną zawartość netto, podawany przez AAPPTEC: masa peptydu podzielona przez sumę masy peptydu i iloczynu liczby przeciwjonów przez 114. Ich własny przykład: peptyd o masie 1000 Da z wolnym N-końcem i jedną argininą daje 1000 / (1000 + 2 × 114) = 81%. I to przy założeniu, że przeciwjony są jedynym składnikiem niepeptydowym — czyli zanim doliczy się wodę.

Podstawmy realne cząsteczki. BPC-157 to piętnastopeptyd o sekwencji GEPPPGKPADDAGLV i masie 1419,53 Da, z wolnym N-końcem i jedną lizyną, czyli dwoma miejscami wiązania. Teoretyczna zawartość netto: 1419,53 / (1419,53 + 228) ≈ 86%. TB-500, czyli acetylowany fragment Ac-LKKTETQ o masie 889,01 Da, nie ma wolnego N-końca, ale ma dwie lizyny — też dwa przeciwjony, tyle że rozłożone na znacznie mniejszą cząsteczkę. Wynik: 889 / (889 + 228) ≈ 80%. Obie liczby są górnymi oszacowaniami; woda resztkowa zbija je jeszcze niżej, a o ile — pokazuje dopiero pomiar.

Reguła jest więc taka: im krótsza sekwencja i im więcej w niej reszt zasadowych, tym gorszy bilans masowy. Bachem zauważa to samo w praktyce — relatywnie niskiej zawartości peptydu należy się spodziewać przy sekwencjach bogatych w aminokwasy zasadowe, zwłaszcza w argininy. Peptyd kwaśny, z przewagą reszt glutaminianu i asparaginianu, wypadnie znacznie lepiej.

Ile cząsteczek TFA przypada na jeden peptyd?

Tyle, ile peptyd ma miejsc zdolnych do przyjęcia ładunku dodatniego — licząc wolny N-koniec i każdą resztę argininy, lizyny oraz histydyny. To oszacowanie górne i uproszczone: rzeczywista stechiometria zależy od pH w trakcie liofilizacji i od tego, czy w sekwencji są reszty kwaśne kompensujące ładunek. BPC-157 ma ich zresztą trzy — jeden glutaminian i dwa asparaginiany — więc realna liczba przyłączonych przeciwjonów może być mniejsza niż dwa. Wartość ze wzoru jest punktem odniesienia, nie wynikiem; wiarygodna liczba pochodzi z pomiaru, nie z kalkulatora.

Osobny przypadek to peptydy z jonem metalu w składzie. GHK-Cu to tripeptyd glicylo-histydylo-lizyna skoordynowany z jonem miedzi(II), więc miedź stanowi tam zamierzoną część cząsteczki, a nie zanieczyszczenie. Bilans masowy trzeba wtedy liczyć od innej podstawy, a porównywanie go wprost z zawartością netto zwykłego liofilizatu nie ma sensu.

TFA to nie tylko arytmetyka na wadze

Gdyby chodziło wyłącznie o to, że za te same pieniądze dostaje się 20% mniej substancji, sprawa byłaby czysto handlowa. Ale przeciwjon nie jest obojętny w układach doświadczalnych.

W 1999 roku Cornish i współpracownicy opublikowali w American Journal of Physiology — Endocrinology and Metabolism (tom 277, strony E779–E783) pracę, w której trifluorooctan w stężeniach od 10⁻⁸ do 10⁻⁷ M obniżał liczbę komórek i wbudowywanie tymidyny w hodowlach osteoblastów płodowych szczura po 24 godzinach. Podobne efekty zaobserwowali w hodowlach chondrocytów stawowych i w sklepieniach czaszki noworodków mysich, co ich zdaniem wykluczało specyficzność wobec jednego typu komórek albo jednego gatunku.

Najwięcej mówi część porównawcza. Autorzy zestawili sole trifluorooctanowe i chlorowodorkowe tych samych cząsteczek — amyliny, jej fragmentu i kalcytoniny — i za każdym razem proliferacja była słabsza przy soli TFA. Wniosek sformułowali metodologicznie: prowadzi to albo do niewykrycia efektu proliferacyjnego, albo do błędnego przypisania cząsteczce działania antyproliferacyjnego, a peptydy badane w stężeniach powyżej 10⁻⁹ M powinno się przed oceną przeprowadzać w sól chlorowodorkową lub biologicznie równoważną.

Drugi przykład jest jeszcze bardziej wymowny. Boullerne i współpracownicy opisali w Journal of Neurochemistry w 2014 roku (tom 129, numer 4, strony 696–703) porównanie dwóch handlowych partii tego samego peptydu MOG35-55 o zbliżonej czystości, ale różnej zawartości netto — 45% i 72%. W modelu zwierzęcym partia o wyższej zawartości peptydu dawała przebieg podobny, ale przy istotnie niższych średnich wynikach w skali klinicznej — mimo że peptydu było w niej więcej. Osobno autorzy porównali tę samą partię w formie trifluorooctanowej i octanowej: przy zbliżonej częstości i nasileniu objawów forma trifluorooctanowa dawała ich początek średnio o około pięć dni wcześniej. Konkluzja: znajomość zawartości netto jest równie istotna jak znajomość czystości, gdy materiał pochodzi z różnych źródeł.

Dwa odczynniki opisane na etykiecie niemal identycznie dały w tym samym eksperymencie różne wyniki. Przegląd Sikory zbiera więcej takich obserwacji — od hamowania proliferacji po kłopot czysto analityczny: TFA ma silne pasmo absorpcji w okolicy 1700 cm⁻¹, które nakłada się na pasmo amidowe I peptydów i białek, co utrudnia analizę strukturalną w podczerwieni.

Czego szukać w certyfikacie analizy

Certyfikat z jednym chromatogramem i procentem czystości opisuje jeden wymiar produktu. Na pełny obraz składa się kilka pozycji:

• Czystość HPLC — z podaną długością fali detekcji (zwykle 214 lub 220 nm) i warunkami gradientu, nie samą liczbą.
• Potwierdzenie tożsamości — spektrometria mas wykazująca zgodność masy zmierzonej z teoretyczną dla danej sekwencji.
• Zawartość netto peptydu — Bachem wskazuje dwie metody: analizę aminokwasową i analizę elementarną azotu. Ta druga działa dlatego, że przeciwjony i woda azotu nie zawierają, więc oznaczony azot pochodzi wyłącznie z materiału peptydowego.
• Zawartość wody — miareczkowanie Karla Fischera.
• Tożsamość i zawartość przeciwjonu — chromatografia jonowa, którą Sikora nazywa techniką pierwszego wyboru. Przegląd wymienia też elektroforezę kapilarną, spektroskopię IR oraz ¹⁹F NMR z charakterystycznym singletem przy −75 ppm.
• Numer partii i data — zgodne z tym, co jest nadrukowane na fiolce. Certyfikat opisujący inną serię nie opisuje niczego.

Co zrobić, gdy w certyfikacie nie ma zawartości netto?

Można oszacować ją ze wzoru, znając sekwencję i liczbę reszt zasadowych, i przyjąć wynik jako granicę górną. Można zapytać dostawcę, czy dysponuje analizą aminokwasową dla tej partii. Czego nie należy robić, to zakładać, że skoro nie podano, to znaczy, że jest wysoka — brak pomiaru nie jest wynikiem pomiaru.

Znaczenie tej liczby rośnie tam, gdzie od masy zależy dalszy rachunek. Przygotowanie roztworu o zadanym stężeniu zaczyna się od masy peptydu, nie od masy proszku. Jeśli pierwsza jest znana z dokładnością do dwudziestu punktów procentowych, ta sama niepewność obarcza objętość wody bakteriostatycznej dobieraną do rozpuszczenia i każde stężenie policzone później. Nie jest to błąd, który da się nadrobić starannością na kolejnych etapach — wchodzi na samym początku i przenosi się dalej bez zmian.

Połowa obrazu

Sprzedawca, który pokazuje wyłącznie czystość, nie musi kłamać, żeby wprowadzać w błąd. Wystarczy, że pokaże ten jeden parametr, przy którym peptydy wypadają najlepiej, i pominie ten, przy którym wypadają najgorzej. Czystość 99% brzmi jak komplet informacji. W praktyce mówi tylko, że wśród peptydów w proszku dominuje ten właściwy — nie mówi, ile tego proszku to w ogóle peptyd.

Zawartość netto rzędu 75–85% nie jest wadą partii ani oznaką nieuczciwości. To normalny wynik standardowego procesu z TFA, znany i opisany w literaturze od dziesięcioleci. Wadą jest dopiero milczenie na ten temat. Producent, który podaje zawartość netto, zawartość wody i tożsamość przeciwjonu, mówi klientowi, co dokładnie sprzedaje. Producent, który podaje samą czystość, zostawia klientowi arytmetykę do wykonania w ciemno.

Na koniec kwestia formalna: część cząsteczek omawianych w tym kontekście — jak analogi GLP-1 — to w Polsce leki wydawane wyłącznie na receptę. Sklep sprzedaje odczynniki laboratoryjne przeznaczone do zastosowań badawczych in vitro, nie produkty do stosowania u ludzi, a powyższy tekst dotyczy wyłącznie dokumentacji analitycznej odczynnika.

Materiał ma charakter informacyjny. Wszystkie produkty Polar Peptides przeznaczone są wyłącznie do badań laboratoryjnych i nie do spożycia przez ludzi ani do zastosowań medycznych lub diagnostycznych.