Молекулярна маса пептиду: дальтони, мас-спектрометрія і доказ ідентичності

Молекулярна маса пептиду — це перше число, за яким хімік перевіряє, чи справді у флаконі та молекула, що заявлена на етикетці. Її вимірюють у дальтонах, розраховують безпосередньо з амінокислотної послідовності й підтверджують мас-спектрометрією. Якщо виміряне значення збігається з теоретичним, ви отримуєте головний доказ ідентичності речовини. Якщо не збігається — різниця майже завжди має конкретне хімічне пояснення, яке вказує, що пішло не так під час синтезу чи зберігання.

Дальтон: одиниця, в якій вимірюють масу

Дальтон (Да, Da) — одиниця атомної маси, що дорівнює одній дванадцятій маси атома вуглецю-12. Числово вона збігається з молярною масою в г/моль: 1419,5 Да означає 1419,5 г на моль. Тисяча дальтонів — це кДа. Для пептидів характерний діапазон від 300 Да до 5 кДа, вище починається територія білків.

• трипептид GHK — близько 340 Да, а його комплекс з міддю приблизно на 60 Да важчий;
• епіталон із чотирьох залишків — близько 390 Да;
• семакс із семи залишків — близько 814 Да;
• BPC-157, п’ятнадцять залишків — близько 1419,5 Да;
• повний 43-амінокислотний ланцюг тимозину бета-4 — близько 4,9 кДа.

Звідси практичний висновок: назва на етикетці може бути однаковою, а маса — принципово різною, якщо синтезовано короткий фрагмент замість повного ланцюга. Про будову цих молекул — у матеріалі що таке пептиди.

Як послідовність визначає молекулярну масу пептиду

Маса не береться з довідника — вона рахується. Коли дві амінокислоти утворюють пептидний зв’язок, виділяється молекула води, тому кожна вносить у ланцюг не повну свою масу, а масу залишку: повна мінус 18,02 Да. Звідси формула: сума залишків плюс 18,02 Да на кінцеву воду.

Залишки різняться суттєво: гліцин додає 57,02 Да, лейцин та ізолейцин — по 113,08, тирозин — 163,06, а найважчий триптофан — 186,08 Да. Середній залишок важить близько 110 Да, тому для швидкої прикидки кількість амінокислот множать на 110. Модифікації зміщують результат передбачувано: ацетилювання N-кінця додає 42 Да, амідування C-кінця віднімає близько 1 Да, замикання дисульфідного містка забирає 2 Да, а великі приєднані групи на кшталт DAC — сотні дальтонів.

Моноізотопна і середня маса: дві правильні цифри

У сертифікатах трапляються два різні числа для однієї молекули, і обидва коректні. Вуглець у природі приблизно на 98,9 % представлений ізотопом 12C і на 1,1 % — важчим 13C; схожа картина з азотом і сіркою. Моноізотопна маса рахується лише за найлегшими ізотопами, середня — з урахуванням природного співвідношення ізотопів, тому вона завжди трохи більша.

Для молекули близько 1400 Да різниця становить приблизно 0,8 Да, для 5 кДа — вже близько 3 Да. Прилади високої роздільної здатності зазвичай дають моноізотопне значення, MALDI-TOF на великих пептидах — усереднене. Тому перше питання до будь-якого «розходження»: а чи ті самі величини порівнюють?

Навіщо масу перевіряють мас-спектрометрією

Мас-спектрометр не зважує молекулу напряму — він іонізує її та вимірює відношення маси до заряду (m/z). При електророзпилювальній іонізації (ESI) пептид набирає кілька протонів одночасно, і в спектрі видно серію піків різної зарядності, які програма перераховує в масу нейтральної молекули. При MALDI-TOF переважає однозарядний іон, і спостережуване значення на 1,007 Да більше за саму молекулу — за рахунок приєднаного протона.

Важливо розділяти дві перевірки. Хроматографія відповідає на питання «наскільки чиста речовина», мас-спектрометрія — «а що це взагалі за речовина». 99 % чистоти нічого не варті, якщо основний пік — не той пептид. Методи детально порівняні в статті про чистоту пептидів за HPLC та мас-спектрометрією.

Що означає розбіжність між теоретичною і виміряною масою

Точність сучасних приладів вимірюється в частках на мільйон: 10 ppm для молекули 1400 Да — це лише 0,014 Да. Тому будь-яке відхилення понад десяті долі дальтона несе інформацію. Найтиповіші зміщення:

• +16 Да — окиснення, найчастіше метіоніну до сульфоксиду;
• +1 Да (точніше +0,98) — дезамідування аспарагіну або глутаміну;
• −17 Да — утворення піроглутамату з N-кінцевого глутаміну;
• −18 Да — втрата води, дегідратація;
• +22 Да — натрієвий аддукт, коли натрій заміщує протон;
• +56, +100 або +242 Да — залишки захисних груп (tBu, Boc, тритил), не зняті після твердофазного синтезу;
• мінус маса цілого залишку (−57 гліцин, −113 лейцин, −163 тирозин) — делеційна послідовність, у якій під час синтезу пропущено амінокислоту.

Останній випадок найпідступніший: пептид з однією пропущеною амінокислотою за хроматографічною поведінкою майже не відрізняється від цільового й може ховатися під основним піком. Мас-спектр бачить його одразу — різниця в сотню дальтонів не маскується нічим.

Чому маса — головний, але не єдиний доказ ідентичності

Збіг мас означає, що елементний склад молекули правильний. Але сума не розповідає про порядок доданків. Лейцин та ізолейцин мають однакову масу, D- і L-форми теж, а переставлена послідовність із тих самих залишків дасть ту саму цифру. Тому для повного підтвердження застосовують тандемну мас-спектрометрію: молекулу дроблять на фрагменти й за їхніми масами відновлюють послідовність.

Друге обмеження: маса нічого не каже про кількість. У флаконі поруч із пептидом є сіль, залишковий трифтороцтовий буфер і зв’язана вода, тому вміст чистого пептиду завжди менший за вагу порошку. Це окремий рядок у документах — і саме тому сертифікат аналізу партії варто читати цілком, а не лише дивитися на відсоток чистоти. У каталозі Polar Peptides COA прикріплений до кожної партії, а Polar Peptides Україна вказує в описі товару і формулу, і розрахункову масу — щоб їх було з чим звіряти.

Часті запитання

Що таке молекулярна маса пептиду?

Молекулярна маса пептиду — це сумарна маса всіх атомів молекули, виражена в дальтонах. Її обчислюють як суму мас амінокислотних залишків плюс 18,02 Да на кінцеву молекулу води. Числово вона дорівнює молярній масі в грамах на моль. Для пептидів типовий діапазон — від приблизно 300 Да у трипептидів до 5 кДа у довгих ланцюгів.

Скільки дальтонів у BPC-157?

Молекулярна маса BPC-157 становить близько 1419,5 Да при формулі C62H98N16O22. Це відповідає п’ятнадцяти амінокислотним залишкам послідовності GEPPPGKPADDAGLV. У мас-спектрі сертифіката має фігурувати значення саме цього порядку. Суттєво інша цифра означає, що синтезовано іншу молекулу, незалежно від назви на етикетці. Паспортні дані інших реагентів є в категорії пептидів для відновлення.

Чим моноізотопна маса відрізняється від середньої?

Моноізотопна маса рахується лише за найлегшими ізотопами елементів, а середня враховує їхнє природне співвідношення. Через домішку важчих ізотопів, насамперед вуглецю-13, середня маса завжди більша. Для пептиду близько 1400 Да різниця становить приблизно 0,8 Да й зростає разом із розміром молекули. Тому в документі важливо звіряти між собою однотипні величини.

Яка розбіжність теоретичної і виміряної маси допустима?

Прийнятною вважають розбіжність у межах похибки приладу — на високороздільній техніці це частки дальтона, тобто одиниці ppm. Відхилення в 16, 18, 22 або 42 Да похибкою не є: це сліди окиснення, втрати води, натрієвого аддукта чи ацетилювання. Зміщення на масу цілого амінокислотного залишку вказує на делеційну послідовність і є підставою відхилити партію.

Чи можна за молекулярною масою визначити послідовність пептиду?

Ні, за однією лише масою послідовність не встановлюється. Маса — це сума, і різні порядки тих самих амінокислот дають ідентичне значення; лейцин та ізолейцин узагалі нерозрізнювані за масою, як і дзеркальні D- та L-форми. Для підтвердження порядку залишків потрібна тандемна мас-спектрометрія, що дробить молекулу на фрагменти й читає послідовність за їхніми масами.

Навіщо перевіряти масу, якщо є HPLC?

HPLC і мас-спектрометрія відповідають на різні питання. Хроматографія показує, яку частку зразка становить основний компонент, але не каже, що це за компонент. Мас-спектрометр ідентифікує саму молекулу за її масою. Партія може мати 99 % чистоти й при цьому містити не той пептид — виявити це здатна лише перевірка маси.

Чи впливає молекулярна маса на розведення пептиду?

На концентрацію в мг/мл молекулярна маса не впливає: 5 мг ліофілізату в 2 мл бактеріостатичної води дають 2,5 мг/мл незалежно від того, скільки дальтонів важить молекула. Маса потрібна лише для перерахунку в молярні одиниці, коли протокол вимагає мікромолярних концентрацій. Практичні аспекти описані в матеріалі про зберігання та розведення пептидів.

Матеріал має інформаційний характер. Усі продукти Polar Peptides призначені виключно для лабораторних досліджень і не для споживання людиною, медичного чи діагностичного застосування.